2結(jié)果與分析

2.1生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選

經(jīng)富集分離共得到49株細(xì)菌，初步篩選出14株生長(zhǎng)較好的目的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基。在微生物采油過(guò)程中，表面活性劑和有機(jī)酸可以把原油從巖層中剝離下來(lái)，提高原油流動(dòng)性。因此，以發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液的pH和表面張力的降低為指標(biāo)，對(duì)初篩得到的菌株進(jìn)行復(fù)篩，同時(shí)分析所產(chǎn)生物表面活性劑的類(lèi)型，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1初篩菌株的發(fā)酵測(cè)定結(jié)果

由表1可知，菌株29#、30#、31#、37#、47#的發(fā)酵液的表面張力值及pH較低。選取該5株菌進(jìn)行分析，菌株29#、30#、31#發(fā)酵液的表面張力及pH比較接近，產(chǎn)生的生物表面活性劑均為糖脂，在原油平板上的菌落均為熒光綠色，種子液和發(fā)酵液均為熒光綠色，細(xì)胞均為桿狀且大小相同。因此，判斷該3株菌為同一菌種。復(fù)篩得到的菌株為31#、37#、47#。

2.2生物表面活性劑產(chǎn)生菌的生理生化特性

對(duì)篩選所得菌株進(jìn)行常規(guī)生理生化特性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。根據(jù)表2所示結(jié)果和《伯杰氏(Berge)菌種鑒定手冊(cè)》的描述，可鑒定菌株31#為假單孢屬，菌株37#、47#均為芽孢桿菌屬。

表2生物表面活性劑產(chǎn)生菌的生理生化特性

2.3生物表面活性劑產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)特性

2.3.1菌株31#的生長(zhǎng)特性

菌株31#的生長(zhǎng)特性如圖1所示。在發(fā)酵前48 h，菌株31#細(xì)胞疏水性呈上升趨勢(shì)，菌體密度逐步增長(zhǎng)，發(fā)酵液的表面張力下降。表明較強(qiáng)的細(xì)胞疏水性能增加菌體對(duì)疏水性有機(jī)物的吸附，從而增加菌體與有機(jī)物的接觸機(jī)會(huì)，增強(qiáng)對(duì)有機(jī)物的利用能力，導(dǎo)致菌體大量生長(zhǎng)并產(chǎn)生大量的生物表面活性物質(zhì)，使發(fā)酵液的表面張力大幅度下降，產(chǎn)生的生物表面活性物質(zhì)通過(guò)改變吸附界面的特性來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞與界面之間的親和力，進(jìn)一步促進(jìn)微生物細(xì)胞對(duì)烴類(lèi)化合物的附著和烴類(lèi)化合物穿透細(xì)胞膜間隙。在發(fā)酵48～84 h期間，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期，細(xì)胞疏水性下降，發(fā)酵液的表面張力呈下降趨勢(shì)，這是部分菌體自溶釋放出細(xì)胞內(nèi)的生物表面活性物質(zhì)的結(jié)果。在發(fā)酵84～108 h期間，細(xì)胞疏水性呈下降趨勢(shì)，發(fā)酵液的表面張力隨菌體密度增大而增大，表明菌體攝取烴類(lèi)化合物能力降低，利用發(fā)酵液中積累的生物表面活性劑呈現(xiàn)二次生長(zhǎng)。在發(fā)酵108～120 h期間，細(xì)胞疏水性上升，表面張力下降。由于31#為革蘭氏陰性菌，細(xì)胞外壁中存在與其疏水性密切相關(guān)的脂多糖，發(fā)酵液中大量積累的生物表面活性劑導(dǎo)致細(xì)胞壁中脂多糖大量流失，從而引起細(xì)胞疏水性增大。

圖1菌株31#的好氧培養(yǎng)過(guò)程曲線(xiàn)

2.3.2菌株37#的生長(zhǎng)特性

菌株37#的生長(zhǎng)特性如圖2所示。在發(fā)酵過(guò)程中，細(xì)胞疏水性總體呈上升趨勢(shì)。發(fā)酵24 h時(shí)，細(xì)胞疏水性大于1，菌體密度隨細(xì)胞疏水性的增大而增大。發(fā)酵36 h時(shí)，發(fā)酵液的表面張力降低，這是因?yàn)闊N類(lèi)的難溶性使得微生物在攝取烴類(lèi)生長(zhǎng)過(guò)程中往往伴隨著生物表面活性劑的生成，其主要作用是使烴類(lèi)在水溶液中有效擴(kuò)散，并滲入細(xì)胞內(nèi)部被同化分解，菌體能夠更好地利用烴類(lèi)碳源生長(zhǎng)，菌體密度上升。在發(fā)酵48～84 h期間，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體密度保持不變。在發(fā)酵84～96 h期間，菌體密度上升，細(xì)胞出現(xiàn)二次生長(zhǎng)。這是由于液體石蠟是一種混合物，菌體首先攝取較易利用的10個(gè)碳以上的長(zhǎng)鏈烷烴，然后再利用其他鏈長(zhǎng)的烷烴進(jìn)行生長(zhǎng)，同時(shí)因?yàn)榧?xì)胞疏水性上升，細(xì)胞利用液體石蠟的能力增強(qiáng)，從而產(chǎn)生大量的生物表面活性物質(zhì)，使發(fā)酵液的表面張力下降。在發(fā)酵96～120 h期間，細(xì)胞疏水性的降低，菌體密度降低，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期，發(fā)酵液的表面張力上升。

圖2菌株37#的好氧培養(yǎng)過(guò)程曲線(xiàn)

2.3.3菌株47#的生長(zhǎng)特性

菌株47#的生長(zhǎng)特性如圖3所示。在發(fā)酵前48 h，菌體密度顯著增長(zhǎng)，細(xì)胞疏水性增大，發(fā)酵液的表面張力降低。在發(fā)酵60～72 h期間，菌體密度減小，細(xì)胞疏水性降低，發(fā)酵液表面張力降低，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期。在發(fā)酵72～84 h期間，菌體密度增加，細(xì)胞出現(xiàn)二次生長(zhǎng)，產(chǎn)生大量的生物表面活性物質(zhì)，使發(fā)酵液的表面張力大幅下降。在發(fā)酵84～120 h期間，菌體密度降低，發(fā)酵液的表面張力在保持一段時(shí)間的基本穩(wěn)定后升高。表明菌體在利用烴類(lèi)生長(zhǎng)過(guò)程中，產(chǎn)生了生物表面活性劑。生物表面活性劑的產(chǎn)生降低了油水界面張力，使烷烴得以有效擴(kuò)散，增大油水界面面積，從而便于細(xì)胞與較大油滴之間的直接接觸，同時(shí)使細(xì)胞的疏水性變大，導(dǎo)致細(xì)胞親油，從而有利于菌對(duì)烴類(lèi)的利用。

圖3菌株47#的好氧培養(yǎng)過(guò)程曲線(xiàn)

2.4生物表面活性劑的化學(xué)組分分析

將菌株31#、37#和47#于30℃培養(yǎng)后，對(duì)發(fā)酵液萃取所得生物表面活性劑粗制品進(jìn)行硅膠薄層層析，結(jié)果如圖4所示。將萃取所得生物表面活性劑粗制品進(jìn)行酸解，硅膠薄層層析結(jié)果如圖5所示。

圖4的層析結(jié)果顯棕色，說(shuō)明菌株31#、37#和47#所產(chǎn)的生物表面活性劑均為糖脂。由圖5可知，菌株31#、37#和47#所產(chǎn)的生物表面活性劑經(jīng)酸解后顯棕色斑點(diǎn)，且Rf值與鼠李糖的Rf值相同，說(shuō)明菌株31#、37#和47#所產(chǎn)的生物表面活性劑的糖基均為鼠李糖。

圖4生物表面活性劑粗品的TLC圖譜

圖5生物表面活性劑酸解后的TLC圖譜

3結(jié)論

通過(guò)對(duì)發(fā)酵液表面張力及pH的測(cè)定，篩選出3株生物表面活性劑產(chǎn)生菌，且所產(chǎn)的生物表面活性劑均為鼠李糖脂；經(jīng)生理生化鑒定，菌株31#為假單胞菌屬，菌株37#、47#為芽孢桿菌屬；通過(guò)對(duì)所篩菌株的生長(zhǎng)特性的研究，說(shuō)明菌體密度、細(xì)胞疏水性、發(fā)酵液的pH及表面張力之間密切相關(guān)，相互制約。在以液體石蠟為唯一碳源培養(yǎng)時(shí)，菌株31#的發(fā)酵液表面張力下降最多，且表現(xiàn)出的細(xì)胞疏水性最強(qiáng)，發(fā)酵液表面張力下降到49.47 mN/m，細(xì)胞疏水性為3.09%。較強(qiáng)的細(xì)胞疏水性有利于菌體對(duì)疏水性基質(zhì)的利用，從而導(dǎo)致菌體密度的增長(zhǎng)及發(fā)酵液表面張力的下降，這對(duì)微生物開(kāi)采稠油十分有利。

生物表面活性劑產(chǎn)生菌菌體密度、細(xì)胞疏水性與發(fā)酵液pH及表面張力的關(guān)系（一）

生物表面活性劑產(chǎn)生菌菌體密度、細(xì)胞疏水性與發(fā)酵液pH及表面張力的關(guān)系（二）