人血白蛋白在臨床上主要用于失血創(chuàng)傷、燒傷引起的休克以及腦水腫和損傷引起的顱壓升高等的治療。人血白蛋白制品中加入適量的辛酸鈉，可以保證制品的穩(wěn)定性，但是辛酸鈉有很多生物學(xué)作用，如引起低血糖癥，對各類動物有麻醉作用，增加氧的消耗，降低肝臟對長鏈脂肪酸的清除作用，血管舒張作用以及降低肌肉收縮力等作用[1]?！吨腥A人民共和國藥典》三部（2020年版）[2]中規(guī)定，人血白蛋白辛酸鈉含量為“每1 g蛋白質(zhì)中應(yīng)為0.140～0.180 mmol”。筆者長期使用該方法發(fā)現(xiàn)，該方法重復(fù)性不理想，容易出現(xiàn)實驗室偏差。經(jīng)分析，出現(xiàn)偏差的原因可能是4 mL三氯甲烷揮干后，再加100μL三氯甲烷溶解殘渣不完全，進樣溶液濃度不能代表供試品溶液濃度，因此筆者擬刪去藥典中辛酸鈉含量測定方法中的“將三氯甲烷揮發(fā)至干，另加三氯甲烷100μL溶解殘渣”，即不揮發(fā)至干直接進樣，開展人血白蛋白辛酸鈉含量測定（氣相色譜法），對優(yōu)化前、后的方法進行對比研究，進一步提升檢驗的效率和水平。

1材料與方法

1.1儀器與設(shè)備

GC-2010Plus氣相色譜儀（配FID檢測器）；BP21色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 um）；CPA225D電子微量天平。

1.2藥品與試劑

辛酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號6827100），純度99.5%，美國CHEM-SERVICE公司；庚酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號6415900），純度99.5%，美國CHEM-SERVICE公司；高氯酸（批號20150701），色譜純，天津政成化學(xué)制品有限公司；三氯甲烷（批號20160106-2），分析純，廣州化學(xué)試劑廠；人血白蛋白供試品（10 g/瓶，批號20180712、20180813、20180814、20180815、20180916、20181017），廣東衛(wèi)倫生物制藥有限公司；人血白蛋白質(zhì)控品（批號20170421-3），廣東衛(wèi)倫生物制藥有限公司；每1 g蛋白質(zhì)中含0.130 mmol、0.160 mmol、0.190 mmol辛酸鈉的加標(biāo)回收率溶液，廣東衛(wèi)倫生物制藥有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

用酸改性聚乙二醇毛細管柱（20 m），柱溫160℃，火焰離子化檢測器，檢測器溫度230℃，氣化室溫度230℃，載氣(氮氣)流速為35 mL/min。

辛酸峰與庚酸峰的分離度應(yīng)大于1.5，辛酸峰的拖尾因子應(yīng)為0.95～1.20，辛酸對照品溶液連續(xù)進樣5次，所得辛酸峰與庚酸峰面積之比的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于5%。

1.3.2內(nèi)標(biāo)溶液的制備

取庚酸，加三氯甲烷制成每l mL三氯甲烷中含10 mg庚酸的溶液，即得。

1.3.3測定方法

取供試品，用水準(zhǔn)確稀釋成蛋白質(zhì)含量為40～50 g/L的溶液，即為供試品溶液。精密量取供試品溶液0.5 mL，加內(nèi)標(biāo)溶液30μL與1.5 mol/L高氯酸溶液0.2 mL，于振蕩器上混合1 min，加三氯甲烷4 mL，加蓋，于振蕩器上劇烈混合2 min，以3 000 r/min離心20 min，除去上層水相，小心將三氯甲烷層傾入10 mL試管中，取0.1μL注入氣相色譜儀。

另精密稱取辛酸對照品0.15 g，置于10 mL容量瓶中，用三氯甲烷溶解并稀釋至刻度，即為辛酸對照品溶液。精密量取辛酸對照品溶液10μL、20μL、30μL、40μL和50μL，分別精密加內(nèi)標(biāo)溶液30μL，于振蕩器上混合1 min，加三氯甲烷4 mL，同法操作。以各辛酸對照品溶液峰面積與內(nèi)標(biāo)溶液峰面積比對各辛酸對照品溶液辛酸量（μg）作直線回歸，求得直線回歸方程，并計算出供試品溶液辛酸絕對量及供試品辛酸鈉含量。

1.3.4重復(fù)性試驗

取人血白蛋白質(zhì)控品（批號20170421-3）作為供試品，重復(fù)測定6次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算辛酸鈉含量。

1.3.5加標(biāo)回收率試驗

取每1 g蛋白質(zhì)中含0.130 mmol、0.160 mmol、0.190 mmol辛酸鈉的加標(biāo)回收率溶液作為供試品，每個濃度分別制備3份進行測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算辛酸鈉含量。

2結(jié)果與分析

2.1系統(tǒng)適用性圖譜峰面積的變化

由表1可知，不揮干，直接進樣法（優(yōu)化后的方法）所得峰面積較小，這是因為優(yōu)化后方法的辛酸對照品溶液不揮發(fā)至干，直接進樣使得濃度變低，峰面積變小，但不影響積分。連續(xù)5針辛酸峰與庚酸峰面積之比的RSD值由藥典方法的0.1%變?yōu)?.0%，但仍符合系統(tǒng)適用性要求（不大于5%）。實驗時間由2 d縮短為1 d。

表1系統(tǒng)適用性結(jié)果

2.2重復(fù)性試驗比較

由表2可知，方法優(yōu)化前、后的重復(fù)性試驗RSD值分別為4%、2%。對兩組數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，F(xiàn)=1.108，P=0.317＞0.05，方差具有齊性，即兩組數(shù)據(jù)精密度無顯著性差異，表明進樣濃度降低并不影響實驗結(jié)果的精密度。

表2重復(fù)性試驗結(jié)果（n=6）

2.3加標(biāo)回收率試驗比較

由表3可知，藥典方法測得的9次回收率的平均值為97.7%，RSD值為1.70%；不揮干，直接進樣法測得的9次回收率的平均值為99.7%，RSD值為1.55%。對兩組數(shù)據(jù)進行單因素方法分析，F(xiàn)=7.530，P=0.02＜0.05,兩組數(shù)據(jù)有顯著性差異。方法優(yōu)化后準(zhǔn)確度更接近100%，這是因為優(yōu)化后的方法不受揮干速度的影響[3]，進樣溶液比藥典方法均勻，損失量相對較小。

表3回收率試驗結(jié)果

2.4樣品含量測定

應(yīng)用優(yōu)化后的人血白蛋白辛酸鈉含量測定方法，對廣東衛(wèi)倫生物制藥有限公司生產(chǎn)的6批人血白蛋白（10 g/瓶）進行辛酸鈉含量測定，結(jié)果見表4。各批次人血白蛋白中辛酸鈉含量均符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定，辛酸鈉含量的平均值為0.161 mmol/g蛋白，RSD值為2%，與理論投料量0.160 mmol/g蛋白較接近。

表4樣品含量測定結(jié)果（n=6）

3結(jié)論

本研究優(yōu)化后的方法不需要將三氯甲烷揮干后再加100μL三氯甲烷溶解殘渣，縮短了試驗時間，減少了揮發(fā)的三氯甲烷對人和環(huán)境的影響。結(jié)果證明，優(yōu)化后的方法重復(fù)性好，準(zhǔn)確度較高，適用于人血白蛋白辛酸鈉含量測定。