摘要

細(xì)胞的糖酵解代謝產(chǎn)生質(zhì)子，這些質(zhì)子通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從細(xì)胞質(zhì)中去除，從而在相鄰的整體溶液和細(xì)胞膜表面之間產(chǎn)生pH差。因此，由于不同的糖萼和質(zhì)子產(chǎn)生能力，組織細(xì)胞具有不同的表面pHs。在這項(xiàng)研究中，我們使用具有pH依賴活性的裂解肽作為探針，證明了細(xì)胞表面pH在肽-細(xì)胞相互作用和肽活化中的作用。適當(dāng)?shù)兀x擇的肽能夠感知細(xì)胞上特定的pH區(qū)域，因此對(duì)具有不同表面pH的組織細(xì)胞表現(xiàn)出不同的活性。對(duì)于特定的細(xì)胞，隨著質(zhì)子通道調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)細(xì)胞表面pH值的升高或降低，pH敏感肽的活性相應(yīng)地發(fā)生變化。機(jī)理研究表明，細(xì)胞表面pH通過改變膜結(jié)合pH敏感肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和聚集狀態(tài)直接影響肽插入膜。根據(jù)正常-癌細(xì)胞對(duì)之間的細(xì)胞表面pH差設(shè)計(jì)的pH敏感裂解肽對(duì)癌細(xì)胞具有良好的選擇性。因此，細(xì)胞表面pHs可能為設(shè)計(jì)具有高細(xì)胞特異性和選擇性的治療肽提供新的機(jī)會(huì)。

介紹

細(xì)胞的糖酵解代謝產(chǎn)生質(zhì)子，這些質(zhì)子通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（如Na+/H+交換異構(gòu)體1（NHE1）（1,2））從細(xì)胞質(zhì)中去除。在不限制質(zhì)子擴(kuò)散的情況下，噴射出的質(zhì)子將在無限的外部溶液中被稀釋。然而，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面覆蓋著一層致密的碳水化合物，由膜錨定糖蛋白和糖脂的共軛低聚糖鏈組成，稱為糖萼（3）。由于這些帶負(fù)電的大分子的存在，質(zhì)子在膜-水界面上的擴(kuò)散確實(shí)受到帶負(fù)電膜表面水的低介電常數(shù)（e）的限制。因此，噴射出的質(zhì)子很容易擴(kuò)散到細(xì)胞膜表面，但不知何故無法迅速與體積平衡。據(jù)估計(jì)，該勢壘可使膜表面的質(zhì)子濃度比本體中的質(zhì)子濃度高10-6 M，從而在細(xì)胞膜表面和相鄰本體溶液之間產(chǎn)生pH差（4,5）。理論上，細(xì)胞表面的特定pH區(qū)可以通過影響細(xì)胞表面電荷、細(xì)胞表面的離子積累、細(xì)胞膜電位、藥物吸收以及肽/蛋白質(zhì)與受體的結(jié)合對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生重大影響。不幸的是，細(xì)胞表面pHs的生物學(xué)重要性和潛在的藥學(xué)意義被忽視了。

我們知道，肽轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)合平面和插入細(xì)胞膜是生物活性肽發(fā)揮其生物活性的關(guān)鍵步驟（6）。在本研究中，選擇一組具有pH依賴性細(xì)胞裂解活性的裂解肽（pH敏感裂解肽）作為探針，通過檢測細(xì)胞表面pHs影響的肽-細(xì)胞相互作用和肽活化來評(píng)估細(xì)胞表面pHs的藥學(xué)意義。

方法和材料

材料

肽（純度>90%）由Genescript公司（美國新澤西州皮斯卡塔韋）合成。將肽溶解在含有10%二甲基亞砜（DMSO）的水中，形成5.0 mM儲(chǔ)備溶液。使用合適的細(xì)胞培養(yǎng)基，從儲(chǔ)備溶液中逐漸稀釋制備肽工作溶液?；?死細(xì)菌染色試劑盒購自Invitrogen Life Technologies（美國加利福尼亞州卡爾斯巴德）。所有其他化學(xué)品均從Sigma-Aldrich Co.（美國密蘇里州圣路易斯）購買。

細(xì)胞培養(yǎng)

所有細(xì)胞均取自美國類型培養(yǎng)物收集中心（ATCC）。A549和CHO-K1細(xì)胞在F12K中生長，NIH/3T3細(xì)胞在DMEM中生長，CCD-Lu13細(xì)胞在MEM中生長。所有培養(yǎng)基均添加10%胎牛血清（FBS）。細(xì)胞在37°C、5%CO2的增濕空氣中培養(yǎng)。

肽的pH敏感性

如前所述（6），在負(fù)載鈣黃綠素的大單膜囊泡（LUV）上測試肽的裂解活性。通過將激發(fā)和發(fā)射波長分別設(shè)置為485和530 nm，使用熒光微孔板讀取器監(jiān)測肽誘導(dǎo)的鈣黃綠素泄漏（通過熒光強(qiáng)度的增加反映）。從LUV釋放的鈣黃綠素表示為F/F0，其中F0和F分別表示在不存在和存在肽的情況下負(fù)載鈣黃綠素的LUV的熒光強(qiáng)度。已經(jīng)證明，pH敏感裂解肽的活性變化通常發(fā)生在狹窄的pH范圍內(nèi)，即所謂的肽轉(zhuǎn)變pH值，即當(dāng)肽的凈電荷為零（6）時(shí)的pH值，如圖1所示。使用納米試劑（6）測定肽的過渡pH值。簡單地說，用不同pH值（pH=5.0–9.0）的PBS稀釋來自儲(chǔ)備溶液（水中5mM）的肽。對(duì)新制備的肽溶液（40 lM）進(jìn)行短暫（60秒）的超聲處理。使用zeta納米分析儀在超聲處理后立即測量肽溶液的zeta電位。

圖1：過渡pH=7.35的肽CL-7的pH依賴性膜裂解活性。

細(xì)胞表面pHs的測量

共有2.59105個(gè)細(xì)胞接種在膠原涂層的覆蓋玻璃上并培養(yǎng)過夜。細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中用熒光素結(jié)合麥胚凝集素（WGA）（12.5 lM）染色30 min，然后將蓋玻璃組裝到FCS2流動(dòng)室系統(tǒng)（BioTechs Inc.，Butler，PA，USA）。使用視頻成像技術(shù)測量pH值。將蓋玻璃置于共焦顯微鏡（LSM510；美國紐約桑伍德卡爾蔡司有限公司）的臺(tái)上，并以0.1ml/min的速度連續(xù)超灌注預(yù)熱（37°C）Hepes緩沖林格溶液（122.5mmNaCl、5.4mmKCl、0.8mmMgCl2、1.2mmCaCl2、1.0mmNaH2PO4·2H2O、5.0mm葡萄糖、10mmHEPES；pH=7.4）波長在458和488 nm之間交替，而發(fā)射的熒光強(qiáng)度記錄在560 nm以上。根據(jù)在458和488 nm處測得的發(fā)射熒光強(qiáng)度計(jì)算出比率。因此，該測量實(shí)際上與給定感興趣區(qū)域中激發(fā)的染料量無關(guān)，并表示局部質(zhì)子濃度（1）。以1.0秒的間隔測量熒光強(qiáng)度，平均測量10次，并通過減去位于測量的感興趣區(qū)域旁邊的對(duì)照區(qū)域的背景強(qiáng)度來校正背景熒光。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，通過使用不同pH值（pH=8.5、8.0、7.4、7.0、6.5和6.0）的改良Ringer溶液（125 mM KCl、1 mM MgCl2、1 mM CaCl2、20 mM Hepes和10 mM nigericin）連續(xù)超濾池，校準(zhǔn)pH測量值。熒光素在6-10的pH范圍內(nèi)具有良好的熒光強(qiáng)度-pH相關(guān)性。

細(xì)胞表面電荷的測定

將細(xì)胞接種于濃度為5 9 104個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)48小時(shí)后，從培養(yǎng)瓶中刮下細(xì)胞，用PBS洗滌，并在0.25 M蔗糖溶液中重新懸浮至最終濃度為106個(gè)細(xì)胞/mL。然后用1%甲苯胺藍(lán)染色細(xì)胞懸浮液90分鐘。之后，用聚1,1-二甲基-3,5-二甲基哌啶氯化銨（CFC）溶液滴定細(xì)胞。根據(jù)先前出版物（7）中描述的程序，通過將總電荷與電池?cái)?shù)量歸一化來計(jì)算電池表面電荷。

肽圓二色光譜的獲取

肽的圓二色譜（CD）光譜記錄在Jasco J-710分光旋光儀上（Jasco公司，美國馬里蘭州伊斯頓）（6）。在25°C條件下，在光程長度為1.0-mm的帶帽石英光學(xué)池中掃描CD光譜。以1.0 nm的間隔從250至190 nm收集數(shù)據(jù)，每個(gè)波長的積分時(shí)間為2秒。對(duì)每次測量的五到十次掃描進(jìn)行平均、平滑、背景減去，并轉(zhuǎn)換為平均殘余摩爾橢圓度[h]（度cm2 dmol?1）。CDPRO軟件用于分析從CD分光旋光儀獲得的數(shù)據(jù)。

肽誘導(dǎo)細(xì)胞裂解的測定

在暴露于肽之前，在96孔板（5 9 103個(gè)細(xì)胞/孔）上過夜培養(yǎng)的細(xì)胞用PBS洗滌三次。在孵育60分鐘后，通過使用乳酸脫氫酶試劑盒測量受損細(xì)胞的乳酸脫氫酶（LDH）釋放，定量評(píng)估肽誘導(dǎo)的細(xì)胞膜損傷。通過將參考波長設(shè)置為690 nm，使用微孔板讀取器（美國VT威努斯基Biotek Inc.）測量490 nm處的吸光度。對(duì)照空白對(duì)照組和100%裂解對(duì)照組，結(jié)果均標(biāo)準(zhǔn)化為細(xì)胞死亡百分比。

肽誘導(dǎo)細(xì)胞膜損傷的動(dòng)力學(xué)

將新鮮胰蛋白酶化的人肺癌A549細(xì)胞接種于膠原涂層的八孔玻璃室內(nèi)（2 9 104個(gè)細(xì)胞/孔），并培養(yǎng)過夜。試驗(yàn)前，用PBS清洗細(xì)胞三次，并用活/死染色試劑盒染色15分鐘。添加肽后，使用蔡司LSM510共焦顯微鏡（卡爾蔡司公司）在不同時(shí)間點(diǎn)記錄細(xì)胞圖像。激發(fā)波長固定在488 nm，發(fā)射波長分別設(shè)置為505–530 nm（活細(xì)胞）和560 nm（死細(xì)胞）。計(jì)算捕獲的細(xì)胞圖像中綠色像素占總綠色和紅色像素的百分比，以估計(jì)細(xì)胞膜完整性（8）。

肽與脂膜的相互作用

使用組裝在微槽X上的脂質(zhì)單層研究肽與細(xì)胞膜的相互作用（芬蘭赫爾辛基Kibron公司）（6）。將DPPC/膽固醇/DPPS（50/10/2.5）的脂質(zhì)混合物溶解在3:1氯仿：甲醇中，形成100 lM脂質(zhì)溶液。向四孔聚四氟乙烯板中添加1.0 mL PBS，然后滴一滴脂質(zhì)溶液。有機(jī)溶劑蒸發(fā)后，在水面形成脂質(zhì)單層。通過特氟隆板的側(cè)孔將肽溶液添加到亞相后，立即記錄肽誘導(dǎo)的表面張力變化。

pH敏感肽對(duì)正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的毒性

使用MTT[3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化鹽]分析，在癌-正常對(duì)（A549和CCD-13Lu）上比較pH敏感和pH不敏感裂解肽對(duì)正常和癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性。簡而言之，將完整培養(yǎng)基中的細(xì)胞加入96孔板（5 9 103個(gè)細(xì)胞/孔）中，并在37°C下培養(yǎng)14–16小時(shí)。洗滌后，用含有不同濃度肽的無血清培養(yǎng)基喂養(yǎng)細(xì)胞，并在37°C下培養(yǎng)2小時(shí)。之后，向每個(gè)孔中加入10 lL MTT（5 mg/mL）。培養(yǎng)4小時(shí)后，通過用含有5%異丙醇和0.1%HCl的10%SDS溶液溶解福爾馬贊并在570 nm（9）處測量吸光度來測定細(xì)胞活力。

肽在溶液中的自組裝和聚集特性

使用熒光探針1-苯胺基萘-8-磺酸（1,8-ANS）（6,10）估計(jì)肽在溶液中自組裝形成肽聚集體。通過將激發(fā)波長設(shè)置為369 nm，在熒光微孔板閱讀器（Biotek Inc.）上記錄了460–500 nm處由肽聚集引起的1,8-ANS（20 lM）熒光發(fā)射光譜增加。

使用zeta納米分析儀測量肽溶液在不同pH下的粒徑和zeta電位變化。在每次測量之前，肽溶液經(jīng)過短暫（60秒）的超聲處理。

利用掃描電子顯微鏡（SEM）研究了肽聚集體的形態(tài)。將肽溶液裝載到硅片上并孵育30分鐘。用去離子水洗滌后，硅片上的肽樣品涂上金。使用Auriga模塊化橫梁工作站（卡爾蔡司公司）獲取SEM圖像。